简介
年3月13日，来自华中科技大学同医院的研究人员在CirculationResearch上发表了题为BMAL1-DownregulationAggravatesPorphyromonasGingivalis-InducedAtherosclerosisbyEncouragingOxidativeStress的研究性文章，报道了牙龈卟啉单胞菌（Pgingivalis,Pg）通过抑制BMAL1表达，从而加重了人主动脉内皮细胞的氧化应激和炎症反应。这项研究结果对于动脉粥样硬化临床治疗具有巨大的指导意义，通过褪黑素和甲硝唑联合用药调节昼夜节律和改善牙周炎有望成为腹主动脉瘤预防及治疗的潜在策略。
研究背景
动脉粥样硬化性心血管疾病(ACVDs)是世界范围内死亡的主要原因。动脉粥样硬化性心血管疾病被认为是慢性炎症过程。除了与心血管系统本身相关的危险因素外，牙周炎相关致病菌(Pgingivalis)也与动脉粥样硬化的发生密切相关，但其潜在机制仍不清楚。本研究主要探讨Pgingivalis对动脉粥样硬化加速的机制，探索动脉粥样硬化性心血管疾病的治疗新策略。研究方法
人体标本：23例ACVDs患者的动脉粥样硬化斑块
动物研究：Bmal1-/-小鼠、ApoE-/-小鼠、Bmal1-/-ApoE-/-小鼠、条件内皮细胞Bmal1敲除小鼠(Bmal1fl/fl；采用Tek-Cre小鼠)，及相应的jet-legged小鼠模型。
基因测序：全基因组RNA测序
研究结果
1、Pgingivalis(Pg)促进动脉粥样硬化的发展并加剧氧化应激通过收集23例ACVDs患者的动脉粥样硬化斑块，并对其细菌相关的DNA进行检测，研究人员发现Pg的阳性率高达82.61%，证实了Pg与动脉粥样硬化存在明显的相关性。研究人员进一步通过在ApoE-/-小鼠中接种Pg，发现小鼠主动脉油红色O区域和主动脉根部斑块面积显著增加。此外，在接种Pg的ApoE-/-小鼠中发现超氧化物自由基的形成显著增加，伴随着促炎因子的上升和细胞凋亡增加。2、BMAL1参与Pg诱导的动脉粥样硬化过程通过对对照组和Pg感染的HAEC全基因组RNA测序，研究人员发现差异表达基因主要聚集在昼夜节律、凋亡、细胞黏附和炎症反应过程，并观察到了昼夜节律基因的改变（BMAL1,CRY1,PER1,PER2,NR1D1）。这些节律基因在Pg处理后的HEACs也呈现出RNA和蛋白水平的下调。此外，这些基因在动脉粥样斑块中也呈现一致的下调趋势。提示Pg可能通过影响昼夜节律促进动脉粥样硬化的进程。3、BMAL1过表达缓解Pg诱导的氧化应激反应研究人员以BMAL1基因作为研究目标，并发现BMAL1在Pg处理的HAECs和HUVECs表达下降，在HASMCs中变化不明显。此外，在HAEC中过表达BMAL1基因发现超氧化物自由基的水平降低、单核细胞的募集减少，促炎细胞因子的水平降低，并且HAEC的凋亡比例明显减少。研究结果提示BMAL1涉及Pg诱导的HAEC氧化应激过程，并在其中发挥拮抗作用。4、昼夜节律紊乱加重Pg接种小鼠中的动脉粥样硬化研究人员构建Bmal1-/-Apoe-/-小鼠。与Bmal1wt/wtApoe-/-小鼠相比，接种Pg的Bmal1-/-Apoe-/-小鼠动脉斑块面积明显增强，揭示了BMAL1基因缺失促进了动脉斑块的发展。此外，在接种Pg的Bmal1-/-Apoe-/-小鼠的动脉中发现超氧化物自由基的形成和促炎因子的表达增加。研究人员进一步通过ApoE-/-小鼠构建生物钟紊乱、Pg接种的动物模型，发现BMAL1的表达水平下降，伴随着动脉斑块面积和富脂病变的增加，并同样观察到超氧化物自由基和促炎因子的表达增加。研究结果揭示了生物节律紊乱促进了Pg诱导的动脉粥样硬化发展过程。5、Pg诱导的氧化应激可促进动脉粥样硬化的发展通过使用活性氧清除剂EUK-对细胞进行处理，发现Pg诱导的超氧自由基恢复到了近正常水平，并显著抑制促炎因子和细胞凋亡，细胞黏附分子的表达也呈现下降的趋势，反应了氧化应激过程在Pg的动脉粥样硬化过程中具有重要意义。然而，研究人员使用活性氧激活剂诱导细胞凋亡的程度明显低于Pg和脂多糖诱导的水平，提示Pg诱导动脉粥样硬化发展还存在其他的机制。6、Pg-p65信号增强BMAL1启动子甲基化并抑制BMAL1转录研究人员观察到Pg感染的HAECs中BMAL1启动子甲基化增加，这表明Pg通过甲基化BMAL1启动子导致BMAL1转录收到抑制。此外，在Pg感染的HAECs中敲除p65基因，并将细胞通过去甲基化试剂Azacitidine(Aza)进行处理。移除Aza后，尽管BMAL1启动子可以重新甲基化，但无论Pg感染与否，p65敲低的HAECs中BMAL1启动子仍保持低甲基化。综上所述，这些数据表明p65是Pg介导的BMAL1高甲基化和转录抑制所必需的。染色质免疫沉淀(ChIP)和双荧光素酶检测证实，p65选择性地与BMAL1启动子(/,bp)在II位点结合，并通过Pg增强了这种关联。7、Bmal1缺失通过正反馈机制提高NF-κB信号通路研究人员通过全基因组RNA测序比较暴露于Pg野生型HAECs和BMAL1敲低HAECs的转录谱。值得注意的是差异表达基因聚集在PI3K-Akt信号通路和NF-κB信号通路。特别是，研究结果证实了NFKB2转录的上调。NFKB2可导致哺乳动物NF-κB家族成员p和p52的上调，既往研究表明p52在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键作用。然而，通过分析Pg接种Bmal1-/-ApoE-/-小鼠的动脉样本，发现Bmal1和p52的表达呈负相关。此外，研究人员注意到Pg感染的BMAL1敲低HAECs中p52蛋白水平上调。p52可以结合到RELB或p50形成NF-κB异二聚体，进一步激活HAECs的下游信号通路并触发氧化应激。综上所述，这些结果表明BMAL1缺失通过NF-κB信号放大和随后的氧化应激增强加重Pg诱导的动脉粥样硬化。8、褪黑素(MLT)和甲硝唑(MTZ)是治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的很有前途的辅助药物在Pg接种ApoE-/-小鼠中，通过MLT和MTZ的联合使用，研究人员发现动脉斑块的面积明显减少，并恢复了BMAL1的表达水平，同时抑制了超氧化物自由基和促炎细胞因子的上升。综上结果阐述了MLT和MTZ的联合使用在治疗和预防动脉粥样硬化疾病中有重要意义。一点讨论
牙周炎相关牙龈卟啉单胞菌(Pgingivalis)已被报道与动脉粥样硬化的发展密切相关，并在内皮功能的调节中发挥重要作用。昼夜节律钟对内皮细胞功能有重要影响，其破坏可加剧动脉粥样硬化斑块的形成。在加重动脉粥样硬化发生的过程中，病原体感染和昼夜节律紊乱之间存在着相互影响。NF-κb-BMAL1-NF-κb信号环路和随后的氧化应激促进被认为是Pgingivalis诱导的动脉粥样硬化斑块形成的新调节因子。褪黑素联合甲硝唑治疗Pgingivalis诱导的动脉粥样硬化是一种有效的治疗策略，这为开发联合药物干预动脉粥样硬化性心血管疾病提供了新的见解。
审校及组稿：医院血管外科张婉医师
编辑：血管资讯Oliver
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