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单细胞测序数据分析与课题设计研讨会（11月14-15）
-10-15
升主动脉瘤（ATAA）以升主动脉薄弱和扩张为主要特征，常导致主动脉夹层、破裂及奇特致命并发症。虽然既往研究表明该疾病主要由于平滑肌细胞丢失和细胞外基质退化导致主动脉退化，但至今其分子及细胞相关机制不明。主动脉壁中，多种细胞发挥不同作用，维持其正常功能。但细胞异质性在既往实验和生物信研究中受到长期忽视。获取细胞特异性改变与异质性特征对理解ATTA的病理过程具有深远意义。
因此，美国Baylor医学院,DeBakey外科中心的YingH.Shen,MD及ScottA.LeMaire团队采用单细胞转录组测序技术对人类降主动脉血管壁进行分析，综合描述了ATAA组织中分子特征，该结果发表于心血管领域顶级期刊《Circulation》中，题目为“Single-CellTranscriptomeAnalysisRevealsDynamicCellPopulationsandDifferentialGeneExpressionPatternsinControlandAneurysmalHumanAorticTissue”
结果解读
人类升主动脉瘤组织中共有11中主要细胞群
研究共分析了来自3名捐助者的正常主动脉壁组织及8名ATAA患者的主动脉瘤组织，共分析个细胞，根据基因表达谱特征及标记基因将其分为11个主要亚群，包括两群平滑肌细胞、成纤维细胞、间充质干细胞、内皮细胞、单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞、T淋巴细胞、自然杀伤性细胞、肥大细胞、B细胞和血浆来源细胞。根据前差异基因，研究者将这11群细胞分为两个主要细胞群——非免疫细胞及免疫细胞。其中3个对照组样本中非免疫细胞成分相对多，而8个主动脉瘤组织中免疫细胞群更多。
Figure1：ATAA及正常主动脉组织中主要细胞类群
非免疫细胞类群特征
为进一步研究非免疫细胞群特征，研究者对该群细胞进行无监督聚类，共得到15种非免疫细胞类群，并对不同类群的特征及细胞间通讯进行评估。
平滑肌细胞的异质性
在15群非免疫细胞中，5群为平滑肌细胞。收缩表型SMC具有ACTC1,ACTA2,MYL9等基因的高表达，但胶原及蛋白聚糖表达较低。相比之下，应激态SMC具有多种应激相关基因，如FOS,ATF3,JUN及HSPB8的表达，表明该类细胞应激反应的激活。增殖性平滑肌细胞亚群高表达细胞周期蛋白和分泌表型基因，如MGP,TPM4,MYH10等。肌成纤维细胞包含肌细胞和成纤维细胞相关基因，包括ACTA2,MYL9,COL1A2,COL8A1。相比于其他SMC亚群，肌成纤维细胞的胶原及蛋白聚糖表达量更高。
成纤维细胞及其他非免疫细胞的异质性
成纤维细胞中有两种亚群高表达COL1A2,DCN,LUM,CLU等。但细胞外基质的mRNA丰度在两个亚群中有少量差异。其中第一亚群高表达弹力素，其细胞间及细胞-细胞外基质间通讯评分较高，而第二亚群高表达原纤维蛋白及蛋白聚糖基因。
间充质干细胞，又称周细胞，也可分为两个亚群。两个亚群中细胞间通讯及细胞-基质通讯评分均较低，第一亚群主要表达收缩相关基因，因此可能参与细胞收缩。而第二亚群主要表达细胞外基质基因，因此可能参与细胞外基质的分泌。
非免疫细胞中包含三种炎症表型细胞，其中炎症1亚群表达T另细胞相关基因，2亚群表达巨噬细胞相关基因，3亚群表达干扰素诱导通路相关基因。
此外，内皮细胞主要分为两个亚群，其中2亚群中细胞间通讯评分更高。
Figure2：非免疫细胞的异质性
单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞的动态改变
单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞可分为10个亚群。研究者根据促炎，及抑炎相关基因将其分为M1型及M2型。其中M1型细胞第二亚群表达上皮生长因子、基质金属蛋白酶抑制剂及软骨素硫酸盐蛋白聚糖基因，表明该亚群除了分泌炎症因子外可能参与组织重构过程。M1性细胞第3亚群也表达MHC1分子相关基因，说明其可能发挥像CD8+T细胞呈递抗原作用。
M2型T细胞第一亚群主要表达PDK4,STAB1,TXNIP等基因，表明其在糖代谢、抗炎及吞噬中其重要作用。一些M2型细胞不全表达M2相关基因，其或可表达干扰素反应性基因、成纤维细胞或平滑肌细胞相关基因或组蛋白相关基因。单核细胞类群主要表达NAMPT,SA9及细胞因子受体基因。表明其可接收信号并分化为巨噬细胞或树突状细胞。
T淋巴细胞特征
T淋巴细胞可分为11个亚群，根据CD4,CD8A,CD88和其他保守性基因的表达，研究者将T细胞重新命名。其中CD4+T细胞可分为发挥促炎及细胞毒性功能的活跃性CD4+T细胞、表达CCR7,IL7R等的静息态CD4+T细胞，以及表达Treg相关基因的调节性CD4+T细胞。
CD8+T细胞主要分为活跃性CD8+T细胞，及终末分化型效应T细胞。另外T_HSP类群包括CD4级CD8两种T细胞，其主要表达应激相关基因。另有一群T细胞表达GTP酶，二者可能参与氧化应激过程。
Figure3：ATAA组织中的细胞异质性
特定细胞类群具有相似应激反应
研究者发现JUN,FOS及HSP基因在应激性平滑肌细胞和T_HSP,T_Stress细胞类群中均为保守性标记基因。既往研究表明37℃胶原酶分离组织时会导致这三种基因的表达升高，因此这三种类群可能由于组织消化导致、并非代表生理状态下类群。
主要细胞类群的表型转变
如上所述，三种非免疫细胞有炎症相关基因表达。其中M_remodeling类群表达平滑肌细胞和成纤维细胞基因，而T_swithced类群表达收缩相关基因。轨迹分析表明，收缩型平滑肌细胞可向此类炎症表型转化。
ATAA组织中线粒体功能减低
为探索ATAA组织中的关键性改变，研究者进一步对比了不同细胞类群中的差异基因。基因集富集分析表明，氧化磷酸化在7中类群中上调。但虽然线粒体未氧化磷酸化的主要场所，多种细胞类群中线粒体基因数量却减少，染色质中氧化磷酸化相关基因增多。对每种细胞中的基因进行比较后发现40个细胞亚群中有24种细胞出现显著的线粒体基因表达减低。因此研究者猜想ATAA组织可能存在细胞线粒体功能的减低，因此在线粒体相关基因抑制状态下，染色质氧化磷酸化基因主要用于维持细胞内能量供应。
非免疫细胞及病变组织中巨噬细胞趋化因子表达增加
与对照组相比，ATAA组织中非免疫细胞比例减低，但免疫细胞——尤其是T细胞比例增加。许多细胞处于细胞周期G1阶段，表明ATAA组织细胞的低增殖速率。但ATAA组织中有23个细胞亚群中趋化因子基因表达水平显著升高，其中12种为非免疫细胞4种为巨噬细胞，表明免疫细胞及巨噬细胞中趋化因子表达上升吸引远端免疫细胞，可能参与ATAA的发生发展。
Figure4：ATAA组织中的分子和细胞改变
ATAA组织差异基因与全基因组关联研究（GWAS）结果相关性
研究者发现ATAA和正常组织中存在上千种差异基因。但是部分基因可能为其他相关基因导致的伴随性变化，未来进一步找寻关进基因，研究者对染色质中所有差异基因进行基因集富集分析，发现差异基因主要集中于4个染色质区域及一个线粒体区域。进一步结合GWAS中单核苷酸多态性结果，研究者发现这4个染色质区域均包含主动脉瘤相关SNP。接下来，研究者计算了富集基因与染色质区域的距离，发现这些差异基因与已知SNP距离相比于随机选择基因更近。根据既往报导基因集，研究者提取出主动脉瘤相关SNP并与本研究得到的差异基因进行关联分析，发现11个基因在对照组和ATAA组中16种细胞内有显著差异，其中TWIST1与EGR为两种编码转录组的基因，后者高表达与54个人体主动脉组织和细胞中。与之相关的SNP为RS.研究者发现ERG在增殖性平滑肌细胞，部分炎症表型细胞、成纤维细胞和内皮细胞中表达减低。为进一步探索ERG在亚群中的靶基因，研究者首先调研了既往研究其调控的靶基因并与差异基因进行交集分析，发现这些基因主要与内皮细胞中的差异基因相似。GO分析表明该内皮细胞下调基因主要富集于细胞凋亡、活性氧相关反应以及内质网相关通路中。成纤维细胞亚群1和增殖性平滑肌细胞亚群中分别有18个基因和6个基因可能受ERG调控。以上结果表明ERG可能为调节主动脉壁正常功能的关键基因，其可能在维持平滑肌、内皮及成纤维细胞的功能中发挥重要作用。
Figure5：ERG在平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞中的潜在作用
结论：本研究运用单细胞测序手段综合评估和描述了正常升主动脉和升主动脉瘤组织的细胞组成和基因表达谱特征，并探索了病变血管壁中差异基因及所在细胞类群。本研究结果为未来进一步研究升主动脉瘤的发生发展提供了重要理论基础。
文献来源：DOI:10./CIRCULATIONAHA..
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