赵成江叶学军陈姣张汉成周汇栋邹志成蔡志明牟丽莎
摘要
目的建立腹主动脉补丁缝合术的异种移植模型以及术后免疫排斥监测平台。方法将野生型巴马猪的颈动脉，修剪成约2.5cm×1.0cm大小的梭形补丁，缝合于食蟹猴腹主动脉，未给予免疫抑制剂。观察受体猴一般情况。术后1年采用病理学检查观察移植物动脉补丁的形态学变化。分别在术前和术后7、14、28、49d采集受体猴血液样本，利用猪的红细胞、外周血单核细胞（PBMC）检测受体猴血清中针对猪抗原的IgM和IgG抗体水平。采用血常规五分类法和流式细胞术检测受体猴血液中淋巴细胞计数。结果3只移植猴存活状态良好。术后1年动脉补丁所在的血管壁外侧组织呈现深红色，苏木素-伊红（HE）染色显示有大量的红细胞和血小板沉积，其中有淋巴细胞的浸润。以猪的红细胞和PBMC为靶细胞，血清中的抗猪IgM和IgG抗体水平在术后28d达到峰值，术后49d时水平有所下降。淋巴细胞、T细胞亚群也是在术后28d达到峰值，49d开始回落。结论动脉补丁缝合术是一种便捷可靠的异种移植模型。没有免疫抑制剂的条件下，受体维持了正常的生理状态。移植物可有效激活受体的免疫系统，诱导抗猪抗体的产生，引发细胞免疫排斥反应，因此该模型可用于监测异种移植过程中的免疫排斥反应。
异种移植；异种抗体；淋巴细胞；巴马猪；动物模型；流式细胞术；外周血单核细胞；红细胞
结果
1受体猴术后一般情况及移植物的病理学结果
3只受体猴的腹主动脉接受野生型巴马猪的动脉补丁移植（图1A），在接受移植后，均未给予免疫抑制剂，保持了良好的生理状态。移植后1年，移植部分肉眼可见，在动脉补丁所在的血管壁外侧组织呈现深红色（图1B），HE染色显示有大量的红细胞和血小板沉积，其中有淋巴细胞的浸润（图2A）。提示移植物所在区域可能有小规模的局部渗血，移植物募集了附近的淋巴细胞迁移至此。发生了凝血和排斥反应。经过受体组织的自身修复，局部形成了坏死。非补丁缝合处动脉HE染色结果显示，动脉结构层次清晰，未见显著异常（图2B）。
特别值得注意的是，我们推测猪的血管移植物被排挤到了猴腹主动脉的外侧，见图2A中的左侧小图，但是Gal染色不能得到阳性结果（未展示）。
2受体猴对猪移植物的产生抗体
受体猴在接受了移植物后，在各个时间点收集血清。以红细胞为靶细胞，在术后14d，血清中的抗猪抗体水平有显著升高，在术后28d达到峰值，术后49d时IgM和IgG水平有所下降（图3A、B）。PBMC为靶细胞，在术后7d时，血清中的抗猪IgM和IgG抗体水平就有显著升高，也是在术后28d时达到峰值，术后49d时IgM和IgG水平有所下降（图3C、D）。无论以何种细胞为靶细胞，IgM和IgG抗体的变化趋势是一致的。
3受体猴术后血细胞分类计数和淋巴细胞亚群计数的变化
M受体猴接受了移植物7d后，白细胞计数开始下降，术后28d开始回升。其中，中性粒细胞计数逐步下降，术后49d时计数恢复正常。淋巴细胞计数在术后7d时下降一半，随后开始上升，术后28d时达到峰值，49d时回落。单核细胞计数相对稳定（图4A）。
采用CD3+CD20－标记T细胞亚群，CD3－CD20+标记B细胞亚群；在CD3阳性细胞群中，CD4和CD8用于T细胞分类；此外，将CD3－CD20－CD8+的细胞，作为不严格的自然杀伤细胞亚群。术后7d，各个亚群细胞均有下降，随着时间推移而逐步上升。与抗体结果类似，在在术后28d达到峰值，49d时已有所回落。CD3+CD20－的T细胞数量上升最多，其中主要是CD3+CD8+的杀伤性T细胞，在术后28d时数量为术前的2倍以上。CD3－CD20－CD8+标记的自然杀伤细胞的数量也超过了术前的2倍。其他亚群的细胞在术后28d的时候，在数量上只是与术前接近，没有显著升高（图4B）。
作者单位
广州，中山大学（赵成江、牟丽莎）；医院（赵成江、叶学军、陈姣、张汉成、周汇栋、邹志成、蔡志明、牟丽莎）