我们检索了GeneExpressionOmnibus数据库，获得了两个基因表达数据集GSE（包括49个AAA样本和10个正常主动脉血管样本）和GSE（包括31个AAA样本），共包括来自AAA的80份样品和来自正常主动脉血管的10份样品。我们使用R(3.61)中的Limma和SVA包校正样本数据。
样本中免疫细胞的浸润
我们使用CIBERSORT，一种用于对基于线性支持向量回归的表达矩阵免疫细胞亚型进行去卷积的工具，以研究免疫细胞在AAA和正常主动脉血管中的浸润，评价和预测样本中免疫细胞的富集情况。CIBERSORT分析了每个样本中22种免疫浸润细胞的相对丰度，包括NK细胞、T细胞、B细胞和巨噬细胞。根据CIBERSORT预测的P值(P0.05)，筛选出69例有意义的样本。主成分分析
我们对样本数据进行了降维并对样本中22种免疫细胞的浸润进行了主成分分析(PCA)。获得免疫反应相关基因的表达谱
从ImmPort中，我们下载了个免疫应答相关基因，包括与抗原呈递细胞、趋化因子及其受体、细胞因子及其受体、干扰素和ILs相关的基因。我们使用R(3.61)中的Limma软件包比较从GeneExpressionOmnibus数据库下载的AAA和正常主动脉样本中免疫应答相关基因的基因表达数据。
筛选差异表达的免疫应答相关基因使用R中的Limma软件包对数据进行标准化后，通过比较正常主动脉血管样本与AAA样本的基因表达谱确定免疫应答相关的差异表达基因。筛选条件：
foldchange
≥1，校正P值（FDR）≤0.05。
蛋白相互作用网络的构建与分析我们利用STRING数据库构建了差异表达基因的蛋白相互作用(PPI)网络。将PPI文件导入Cytoscape3.6.0，并使用MCODE插件映射PPI。将网络中各节点的degree、closeness、intermediatedegree和各蛋白nodaldegree的平均值设定为PPI网络节点的阈值，选择degree大于阈值的蛋白。鉴定PPI网络的关键节点，并计算节点及其相互作用蛋白的相关性评分。
GO和KEGG富集分析
使用clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析。采用超几何分布分析计算这些差异表达基因在各信号通路中的显著性水平，以识别受到显著影响的信号通路(P0.05)。免疫应答相关的差异表达基因的验证
招募了8例接受手术切除的AAA患者，术中所有组织标本均液氮冷冻，并由两名经验丰富的病理学家证实AAA。预处理样品，用TRIzol试剂（德国DBI）提取RNA进行实时定量聚合酶链反应(qPCR)。根据生产商说明，使用BestarqPCRRT试剂盒(DBI,Germany)将RNA逆转录为互补DNA。qPCR测定样本中PI3、MAP2K1、SSTR1、GPER1、CCR10、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α、ACTB（内参基因）的表达水平。引物序列获自PrimerBank（Table1）。统计分析
使用GraphPadPrism7(GraphPadSoftwareInc.)和IBMSPSS17.00(IBMAnalytics,UnitedStates)分析数据。采用Chi-square和Fisher精确检验对数据进行定性分析。数据表示为平均值±标准差(x±s)，并使用Studentst-检验进行比较。使用GraphPadPrism8分析PCR数据。P0.05被视为具有统计学显著性，P0.01被视为具有非常显著性。Results免疫细胞浸润
我们采用CIBERSORT分析样本中免疫细胞浸润情况，根据分析选择符合标准的AAA样本69例和正常主动脉样本10例(P0.05)。我们发现10例正常主动脉样本和69例AAA样本中22种免疫细胞的丰度存在显著差异（图1A）。正常主动脉和AAA样本中浆细胞、T细胞、初始CD4+T细胞、静息记忆CD4+T细胞和M0巨噬细胞的浸润也存在显著差异（图1B）。对22种免疫细胞进行相关性分析发现，静息肥大细胞与活化肥大细胞的负相关最强，巨噬细胞M0与浆细胞、巨噬细胞M0与静息记忆CD4+T细胞、单核细胞与浆细胞的负相关较强。观察到静息CD4+记忆T细胞和初始CD4+T细胞之间以及浆细胞和CD4+T细胞之间呈负相关；观察到初始CD4+T细胞之间呈强正相关（图2A）。图2B显示，正常和AAA样本中有18种免疫细胞比例不同，如静息树突状细胞（图3A）、嗜酸性粒细胞（图3B）、M0巨噬细胞（图3C）、M1巨噬细胞（图3D）、巨噬细胞M2（图3E）、静息肥大细胞（图3F）、单核细胞（图3G）、活化NK细胞（图3H）、活化CD4+记忆T细胞（图3I）、CD8+T细胞（图3J）和挥发性T辅助细胞（图3K）。AAA样本中调节性T细胞的比例（图3L）增加，而正常主动脉样本中活化肥大细胞（图4A）、中性粒细胞（图4B）、静息NK细胞（图4C）、浆细胞（图4D）、静息记忆CD4+T细胞（图4E）和初始CD4+T细胞（图4F）的比例增加。主成分分析
根据样本中22种免疫细胞的浸润进行PCA，结果显示，正常的主动脉和AAA样本可以根据免疫细胞的浸润进行区分（图5A）。差异表达的免疫相关基因的筛选
我们提取并分析了69例AAA和10例正常主动脉样本中免疫应答相关基因表达的差异。结果显示39个免疫应答相关基因上调，个免疫应答相关基因下调（图5B）。蛋白相互作用网络的构建与分析
将39个上调和个下调基因上传至STRING数据库构建PPI网络。PPI网络导入到Cytoscape中并使用MCODE识别相关节点。如图5C、D所示，图中节点的degree越大，颜色越深，节点的直径越大。在上调基因中，SSTR1、GPER1和CCR10的节点最大（degree最高），而在下调基因中，PI3和MAP2K1的节点最大（degree最高）（表2）。GO和KEGG富集分析
Figure6A,B显示，上调的免疫反应相关基因调控的生物学过程包括对生长激素的反应、肽类激素反应、生长因子活性和细胞因子受体活性。这些过程与生长激素反应、JAK-STAT级联的正调控、生长激素受体信号、STAT蛋白酪氨酸磷酸化的调控（图6C，D）和激素介导的信号密切相关。图6
图7A，B显示下调的基因主要参与T细胞活化、肽酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰、外部刺激-反应的负调控、对TNF的反应、细胞趋化，以及免疫反应分子介质、血小板α颗粒和蛋白酪氨酸激酶活性的调控。这与T细胞活化、TNF介导的STAT信号级联正调控、外界刺激反应负调控、蛋白激酶B信号转导正调控、白细胞迁移、白细胞增殖、分化过程中细胞形态发生调控、STAT级联调控、白细胞趋化、和淋巴细胞增殖相关（图7C、D）。图7
差异表达的免疫相关基因的验证
收集了8例AAA样本和6例AAA邻近血管样本。采用qPCR检测SSTR1、GPER1、CCR10、PI3、MAP2K1的表达水平。图5中各靶基因的相对表达量计算如下：相对表达量=2-△CT，其中△CT=靶基因的CT值-内参基因(actin)的CT值。与正常样本相比，AAA样本中SSTR1、GPER1和CCR10的表达水平升高，而MAP2K1的表达水平降低；PI3的表达未观察到显著差异（图8）。我们发现AAA样本中血管炎性因子IL-6、IL-17和TNF-α的表达显著增加（附图）。Discussion节选腹主动脉瘤一直是血管外科研究的重点。随着二代测序发展，越来越多的研究人员开始利用生物信息学技术研究AAA。Wang等人通过比较基因表达和简单构建调控网络，发现UBB、NFIA、sparcl1等基因可能在AAA中发挥重要作用......然而，很少有研究利用生物信息学技术全面分析AAA中免疫细胞的浸润情况，仅有一篇文章分析了破裂腹主动脉瘤和稳定腹主动脉中免疫细胞的浸润情况，但其样本量仅48例，且无实验数据验证。本研究分析了与AAA相关的GSE和GSE数据集。共纳入90例样本，综合分析AAA免疫细胞浸润状态及免疫细胞间的关系。再者，我们通过构建网络筛选了在AAA中起关键作用的基因，并通过收集临床样本进行PCR分析验证了结果，这使得我们的研究成果更加可靠。我们发现正常主动脉样本和AAA样本中22种类型的免疫细胞浸润率存在显著差异。AAA中与M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、肥大细胞静止、单核细胞、NK细胞活化和活化记忆CD4+T细胞相关的细胞比例增加，而与肥大细胞活化、NK细胞静止（图4C）、静止记忆CD4+T细胞（图4E）相关的细胞比例减少。尽管肥大细胞在AAA中的作用尚不明确(Sillesenetal.,)，但主动脉组织中巨噬细胞的募集标志着开始浸润外膜，其促进基质降解物的分泌，从而促进AAA的形成(Blomkalnsetal.,)。活化的记忆CD4+T细胞可通过分化为Th2细胞发挥促炎作用，研究表明AAA中Th2细胞比例增加(Wangetal.,b)。此外，NK细胞可产生促炎因子，如IL-2和干扰素γ，可导致细胞毒活性增加并促进AAA形成(Chanetal.，a，b；Foresteretal.，)。此外，有证据表明单核细胞耗竭可抑制AAA的形成(Wangetal.,)。我们的结果与这些发现高度一致。PCA分析结果显示，通过免疫细胞的浸润可以明确区分正常主动脉和AAA样本。同时，我们的研究证实，与正常主动脉样本相比，AAA样本中炎症因子IL-6、IL-17和TNF的表达显著增加。因此，寻找AAA中关键的免疫相关基因是研究AAA发生、发展的新方向。我们筛选了个免疫反应相关基因，这些基因在正常主动脉血管样本和AAA样本中差异表达，包括39个上调基因和个下调基因。这些基因被用来构建PPI网络。发现SSTR1、GPER1和CCR10是上调基因网络中的重要基因，而PI3和MAP2K1是下调基因网络中的重要基因。SSTR1是5种生长抑素受体(SSTR)之一，在神经内分泌肿瘤中发挥重要作用，如肺类癌(Vesterinenetal.,)，SSTR1的过表达可抑制细胞增殖(Zouetal.,)。与正常子宫组织相比，GPER1在子宫平滑肌瘤中的表达更高，细胞迁移增加(Kimetal.,)，这可能是其在AAA中高表达的一个原因。CCR10是介导趋化因子的重要受体，它通过内皮细胞参与血管生成。可通过抑制CCL28与CCR10的反应促进血管生成，改善伤口愈合(Chenetal.,)。对同一数据集的研究也表明，趋化因子及其配体在AAA中上调，并可与其他因子相互作用在AAA中发挥作用。如CCL4L1、CCL3L3、CXCL1、CXCL2、CXCL13、CCR7在AAA中均高表达(G?beletal.,;Ganetal.,)。......PI3是炎症发生、发展的重要介质，由浸润的中性粒细胞合成和分泌。脂多糖、弹性蛋白酶和TNF-α也可促进其生成，尽管炎症刺激持续存在的气道和粘膜中PI3的表达增加(Sallenaveetal.,；Pfundtetal.,,2；Reidetal.,)，但这并不意味着PI3是一种促炎因子。相反，PI3似乎在炎症中起保护作用；例如，它在急性呼吸窘迫综合征急性期下调，在一项实验研究中，对照受试者的血浆PI3水平远高于呼吸窘迫综合征患者。因此，PI3表达降低可能导致机体对炎症的耐受性降低(Tejeraetal.，)。MAP2K1的突变被认为是颅外动静脉畸形最常见的原因。MAP2K1编码MAP-细胞外信号调节激酶1(MEK1)，通过RAS/MAPK信号通路影响细胞发育。颅外动静脉畸形的特征是血管内皮细胞功能障碍和促进动静脉畸形（Couto等人，；Konczyk等人，）。这些发现大多与我们的结果一致。在我们的研究中，对差异表达基因的GO和KEGG分析显示，上调的基因主要参与生长激素反应、肽类激素反应、生长因子活性、细胞因子受体活性、JAK-STAT级联的正调控和激素介导的信号传导。下调的基因主要参与T细胞活化、外界刺激-反应的负调控、对TNF的反应、细胞趋化、免疫反应分子介质的调控、T细胞活化以及白细胞迁移和增殖。这些生物学过程和途径与炎症和免疫密切相关。关于AAA的其他研究也证实，细胞因子与细胞因子受体、趋化因子信号通路和T细胞受体信号通路之间的相互作用在AAA的发生、发展中起重要作用（Biros等，）。因此，我们认为SSTR1、GPER1、CCR10、PI3、MAP2K15个免疫反应相关基因可能在AAA的形成中发挥重要作用。这项研究有一个小样本量测量选择基因表达的局限性；确实，这可能是我们发现PI3表达没有显著差异的原因。因此，我们计划对选择的基因进行更深入的研究，以阐明这些基因在AAA发生中的作用机制。Conclusion本研究通过分析AAA芯片数据，发现正常主动脉和AAA样本可通过免疫细胞的浸润明确区分，并鉴定出关键的免疫反应相关的差异表达基因SSTR1、GPER1、CCR10、PI3和MAP2K1。基于我们的研究结果和文献，我们推测这5个基因参与了免疫反应，并在AAA的发生发展中发挥重要作用。这些基因可能是AAA诊断和治疗的关键靶点。小结与思考该研究中使用的生物信息分析技术和基础实验或许并不难实现，其研究切入点（AAA免疫细胞浸润、与免疫相关基因集关联）、实验设计、与AAA背景知识的融合、故事逻辑等方面更值得思考和总结。个人认为，本文还可进行一些拓展，比如基于基因表达值构建AAA诊断模型，如果结果不错，关键基因的临床意义或可得以进一步升华。相对于肿瘤领域的生信文章，非肿瘤生信大多可实现降维打击，结合自己学科专业的病种或换一个切入角度，可以借鉴本文的研究思路。参考：NieH,QiuJ,WenS,ZhouW.CombiningBioinformaticsTechniquestoStudytheKeyImmune-RelatedGenesinAbdominalAorticAneurysm.FrontGenet.;11:.PublishedDec10.doi:10./fgene..
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